实验目的:验证沛欧SKD-200型凯氏定氮仪对低蛋白量样品的检测准确度与度
实验设计人:沙金
实验执行人:沙金
实验时期:2010-3-11
仪器与试剂:
凯氏定氮仪(SKD-200,上海沛欧分析仪器有限公司)
精密分析天平(FA2004,上海精科天平厂)
通风橱
水槽
500mL三角瓶若干
25mL酸式滴定管
50mL量筒
1mL移液器与枪头
10mL离心管
药匙
称量纸
固体硫酸钾/硫酸铜催化剂=3:1(w/w)
样品1:0.5mg/mL BSA 2mL(containing 50% glycerol)
样品2:0.5 mg/mL 大豆浸提液 2mL (containing 50% glycerol)
样品3:标准硫酸铵 (1mg N/mL)
空白对照:saline (containing 50% glycerol)
浓硫酸(AR)
35% NaOH
2% H3BO3
混合指示剂:0.1%溴甲酚绿乙醇溶液:0.1%甲基的红乙醇溶液=5:1
0.1N NaOH
0.1N HCl
0.01037N 滴定用HCl
操作步骤:
1. 消化:
将预先称量好的固体硫酸钾/硫酸铜催化剂粉末约6g(可适当加量)小心加入洗净干燥的消化管底部;分别将样品1、2和空白对照(约2mL)各两份用分析天平差减法直接倒入消化管底部,记录各组重量;用量筒小心称取浓硫酸16mL加入各消化管底部。将消化管放在管架上,放入消化炉,启动通风橱。设置消化温度时间曲线:170℃(根据样品碳化和沸腾的情况,可适当提高或降低预消化温度,并尽量避免样品碳化沸腾挂壁以提高检测准确度),30min——250℃,10min——370℃(为保证消化效果,可根据情况适当提高至400℃以上),120min。当消化管内出现稳定的恒沸白色酸雾并回流时,可盖上消化管盖以减少硫酸损失。当样品被消化为明亮的蓝绿色或绿色液体时,即可停止消化,待其冷却至室温后,取出蒸馏,关闭通风橱。
2. 蒸馏:
向凯氏定氮仪的三个储液桶中分别加入足量的35%NaOH、2%H3BO3和蒸馏水(根据处理样品量,至少1L),旋紧储液桶盖子。开机,打开循环水,不放入样品,预蒸馏2min。向样品管中小心加入20mL蒸馏水以稀释硫酸,待其变为明亮的蓝色溶液时,小心放入蒸馏架,卡紧卡槽时注意将消化样品管口卡紧以防止氨蒸气流失;向500mL接收三角瓶中加入少量(约0.6mL)混合指示剂,并设定加硼酸12s,加碱8s,蒸馏8—9min,保存设置后启动仪器。当氨蒸气随冷凝水流出时(注意氨蒸气管出口浸没于接收三角瓶的硼酸溶液中),接收瓶中的硼酸溶液会由玫红色变为蓝色,待蒸馏完毕,用蒸馏水将氨蒸气管出口的残液冲洗入接收瓶后取出待测。将样品管取出,小心倒入水槽,并及时清洗。放入下一个样品管和接收瓶,重复以上操作。蒸馏完毕后,关闭循环水。待蒸馏水冷却后放出。如短时间内不再使用定氮仪,应用蒸馏水替换酸液和碱液,重复加酸加碱过程以清洗酸碱管路,维护设备。
3. 滴定
用0.1N NaOH、0.1NHCl、蒸馏水分别润洗酸式滴定管各三次,zui后用0.01037N滴定用标准HCl润洗两三次。加入0.01037N滴定用标准HCl,并小心放液至0刻度。开始滴定,左手控制滴定速度,右手不断摇动混匀三角瓶中溶液。(可预先对样品消耗盐酸量有一个大致的估计,即每毫升0.01N盐酸可滴定约0.14mg氮)临近滴定终点时溶液开始由蓝色变为蓝灰色,在zui后一滴或半滴时微微呈现紫红色。视线与滴定管水平时读取并记录盐酸消耗量。用0.01037N滴定用标准HCl补满至0刻度后,可滴定下一个样品。
实验结果:
1. 各组样品取样量:
| 空白对照 | BSA (0.5mg/mL) | 大豆浸提液(约0.5mg/mL) |
取样前(g) | 9.823 | 9.191 | 9.702 |
*次取样后(g) | 7.391 | 6.639 | 7.016 |
第二次取样后(g) | 4.359 | 4.506 | 4.316 |
*次取样量(g) | 2.432 | 2.552 | 2.686 |
第二次取样量(g) | 3.032 | 2.133 | 2.700 |
*次取样量(mg) | 0.00 | 1.1285 | 1.1878 |
第二次取样量(mg) | 0.00 | 0.9432 | 1.1940 |
注:甘油密度1.2613g/mL,生理盐水密度1.00 g/mL,则样品溶液密度1.1307g/mL
蛋白取样量(mg)= 取样量(g)/ 样品溶液密度 X 0.5 mg/mL
2. 各组样品消耗盐酸量:
| 空白对照 | BSA (0.5mg/mL) | 大豆浸提液(约0.5mg/mL) |
*次取样量(g) | 2.432 | 2.552 | 2.686 |
第二次取样量(g) | 3.032 | 2.133 | 2.700 |
*次盐酸消耗量(mL) | 0.40 | 2.04 | 2.36 |
第二次盐酸消耗量(mL) | 0.45 | 1.64 | 2.44 |
*次滴定氮量(mg) | 0.058 | 0.296 | 0.343 |
第二次滴定氮量(mg) | 0.065 | 0.238 | 0.354 |
平均氮含量(mg/mL) | 0.026 | 0.129 | 0.146 |
平均蛋白含量(mg/mL) | 0 | 0.577 | 0.724 |
检测准确度 |
| 高于真实值15.4% | 高于真实值约44.7% |
检测度(SD%) | ±7.26% | ±2.75% | ±1.99% |
注:每消耗1mL0.01N的盐酸相当于0.14mg氮;动物胶K=5.6(N=18.0%),大豆制品K=6.0(16.7%)。
讨论:
从检测结果看,当测量氮含量为0.18mg时,标准偏差控制在±3%以内,而空白对照的含氮量进一步下降为0.03mg时,标准偏差仍控制在±10%以内,实验结果重复性较为理想。但两组实验测量值均大于真值,分析原因:1)BSA组高15.4%,怀疑实验场所距动物房较近,造成结果偏高。2)大豆浸提液组高44.7%,怀疑不仅有1)的原因,而且浸提液中含有较高的非蛋白氮干扰,建议将浸提蛋白沉淀后再以凯氏定氮法测量。
另:以标准硫酸铵检测的蒸馏回收效果,实验结果表明:当氮含量为1mg时,以1500W蒸馏器蒸馏8min,平均氮回收率为96.9%;以1500W蒸馏器蒸馏9min,平均氮回收率可达100%,蒸馏回收效果理想。建议对于低蛋白含量样品测量而言,降低蒸馏器功率,并适当延长蒸馏时间可进一步改善回收率,从而使结果重复性更好
注:作者系上海我武生物公司研发部生化博士